粪菌移植揭示肠道菌群失调可引发乳腺炎
导读
乳腺炎是哺乳动物中常见的疾病之一，奶牛的乳腺炎会导致巨额经济损失、增加细菌耐药性、抗性基因污染，最终威胁食品安全。本文在奶牛肠道菌群结构与功能研究基础上，进一步验证肠道菌群与乳房炎发病的关联；通过奶牛到无菌小鼠的跨物种粪菌移植，证实失调的肠道菌群可能是引发乳腺炎的原因之一，恢复肠道菌群功能的益生菌（如本研究中使用的LactobacilluscaseiZhang）是潜在的治疗策略。
论文ID
原名：Cow-to-mousefecaltransplantationssuggestintestinalmicrobiomeasonecauseofmastitis
译名：奶牛到小鼠的粪菌移植提示肠道微生物组是导致乳腺炎的一个原因
期刊：Microbiome
IF：10.
发表时间：.11.8
通讯作者：张和平，魏泓，徐健
DOI:10./s---1
背景
乳腺炎是一种潜在的致命性的炎症反应，影响着几乎所有的哺乳动物。在奶牛业中，乳腺炎是最常见以及花费最多的疾病，不仅会导致奶牛的产奶量下降，而且对动物机体健康状态也有影响。
尽管对牛乳腺炎的病因研究了数十年，但关于是否是由特定病原体引起的仍不清楚。一方面认为，特定的病原体侵入和定植乳腺导致乳腺炎的发生。另一方面，大量的证据与此观点违背。虽然金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等常见的乳房微生物群被认为与乳腺炎有关，但它们并非均存在于所有奶牛乳腺炎的病例中。此外，接种超高剂量的乳腺链球菌可以导致牛乳腺炎，但健康奶牛的乳腺内也存在链球菌。因此，乳腺菌群以外的因素如肠道菌群失调可能在乳腺炎的发生中发挥作用。
实验设计
1.比较健康奶牛和乳腺炎奶牛的肠道菌群差异
选取3-6岁的12头乳腺炎奶牛的以及12头体重相似、年龄相仿、健康的奶牛，取粪便进行测序分析。
2.粪菌移植（FMT）
选取3个奶牛场3-6岁平均体重Kg的的荷斯坦奶牛作为粪便菌群的供体，受体为35只怀孕的12周龄雌性C57BL/6J无菌小鼠。将35只无菌小鼠分为三组，接受来自健康奶牛和乳腺炎奶牛的FMT（H组-健康奶牛FMT，11只；M组-乳腺炎奶牛FMT，12只；P组-乳腺炎奶牛FMT并给予益生菌治疗，12只）。FMT25天后，处死小鼠，采用组织病理学检查来评估小鼠乳腺、肝脏以及肠道的炎症情况并对三组小鼠进行炎性细胞因子定量检测，取粪便进行测序分析。
结果
1.乳腺炎奶牛与健康奶牛的肠道菌群差异
对乳腺炎和健康奶牛的粪便DNA进行16s测序，结果表明，它们β-多样性存在显著差异。31个细菌操作分类学单位(OTU)与牛乳腺炎显著相关（图1），它们属于厚壁菌门（在健康奶牛中富集的丁酸弧菌属、Dorea属、毛螺菌属和罗斯氏菌属；在乳腺炎奶牛中富集的颤螺菌属和瘤胃菌科）和拟杆菌门（均在健康奶牛中富集）。
图1健康奶牛和乳腺炎奶牛之间显著差异的31个OTU
为了鉴定乳腺炎相关功能基因，对粪便样本进行鸟枪测序，并根据编码的细菌基因图谱进行比较。结果表明，患病牛和健康牛的β-多样性也有显著差异，表明在奶牛乳腺炎中，肠道微生物群的组织结构和功能结构都发生了改变。KEGG通路分析表明，在乳腺炎奶牛中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成和D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢的两条途径富集。维生素B相关的代谢途径均不富集。肠道微生物是哺乳动物宿主体内维生素B的主要来源，患乳腺炎的奶牛无法合成维生素B。因此，乳腺炎可能与肠道微生物群维生素B代谢紊乱有关。
2.乳腺炎奶牛FMT后引起无菌小鼠乳腺炎，益生菌的摄入缓解了乳腺炎
三组小鼠FMT后炎症反应的比较显示，乳腺炎奶牛的肠道菌群比健康奶牛的肠道菌群诱导的炎症反应（乳腺、肝脏、空肠和结肠）要大得多。在乳腺表面，M组出现与乳腺炎相对应的严重炎症，而H组和P组则未见明显的病理改变（图2a）。在苏木精-伊红（HE）染色下，M组表现为乳腺小叶破裂，腺泡受损，上皮细胞破坏，小叶内可见巨噬细胞、中性粒细胞和血细胞等炎性细胞（图2b）。小鼠肝切片HE染色显示M组肝叶模糊，充血，肝细胞气球样变性，而H组肝结构正常，P组肝结构恢复（图2d）。M组小鼠粘膜结构严重紊乱（上皮细胞坏死、上皮下间隙延长、绒毛结构受损），H组小鼠肠粘膜正常，绒毛完整，P组益生菌摄入明显改善肠道状态，粘膜肿胀减轻，上皮下空间扩张较少，绒毛结构排列良好（图2e,f）。总的来说，M组的乳腺、肝、空肠、结肠的损伤程度均明显高于H组和P组（图2g）。
图2FMT及益生菌干预后小鼠组织学分析
为了评估小鼠乳腺免疫信号通路的激活，在FMT后第25天用Westernblot检测了9种关键细胞因子（NF-κb信号途径中的NF-κb和Iκb-β；MAPKs信号途径中的ERK、p38和JNK；DNA结合蛋白STAT3；膜结合胆汁酸受体TGR；细胞体积和上皮损伤修复的基本调节因子CLC4和Akt）（图3a）。M组的9种细胞因子中除CLC4和JNK外剩余7种的水平明显高于H组。P组细胞因子水平介于M组和H组之间（CLC4除外）。P组NF-κB水平较M组低57.7%，提示益生菌的抗炎作用与抑制NF-κB途径活化有关。
图3益生菌（干酪乳杆菌）对乳腺炎小鼠的影响
通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了主要由活化巨噬细胞产生的多种小鼠炎症细胞因子（图3b），与H组相比，M组小鼠的所有细胞因子水平均升高（p0.01），这与该组FMT后炎症反应明显增高一致。P组小鼠乳腺组织病理学减轻，益生菌引起的细胞因子分泌上调可能是P组乳腺炎症状减轻的基础，M组血清内毒素水平最高，提示肠道细菌可能通过肝肠循环进入血液系统，导致乳腺炎症。
对FMT后的无菌小鼠的肠道菌群测序结果分析显示，H组和M组小鼠之间的β-多样性差异非常显著。乳腺炎小鼠的丙酮酸代谢、半乳糖代谢、柠檬酸循环和糖酵解/糖异生途径均耗尽。然而，乳腺炎小鼠体内两条维生素B代谢途径硫胺素和生物素代谢，以及糖胺聚糖和其他聚糖的降解途径均富集，这与患乳腺炎牛相反。这些结果表明，小鼠乳腺炎可能与糖胺聚糖的减少有关，是由于小鼠肠道微生物群有更高降解活性。
3.益生菌对小鼠乳腺炎缓解的作用机制
益生菌的摄入虽然缓解了乳腺炎，但结果表明，益生菌未显著改变受体中失调的肠道菌群，但改变了菌群功能，与健康和乳腺炎菌群的均有区别。
P组小鼠的肠道微生物的分类结构与M组和H组均不同（图4）。实际上，P组的分类结构与M组更相似，表明益生菌的摄入使P组的微生物群结构从乳腺炎状态到健康状态有一定程度的恢复。M组的糖胺聚糖降解活性远高于H组，说明益生菌的摄入可能是通过抑制构成此类降解活性基础的拟杆菌属OTU来降低糖胺聚糖降解的程度。
图4三组小鼠之间的差异OTU
4.FMT导致小鼠中的菌群差异扩大
跨物种的FMT不仅导致了乳腺炎症状的保存，而且还导致了肠道微生物群差异的放大。健康与患病奶牛的肠道菌群差异，在受体小鼠中被放大。
经过检测发现，受体无菌小鼠的肠道微生物群中，大部分的家族级分类群都来自于供体牛的肠道微生物群（健康奶牛：91.8%；乳腺炎奶牛：94.2%）。然而，只有毛螺菌科在健康小鼠和牛中表现出相同的富集趋势，毛螺菌科仅占患乳腺炎和小鼠细菌丰度的3%，但在健康小鼠中占40%，健康牛中占5%。因此，毛螺菌科菌群的丰度可能与乳腺炎有关。
从功能角度看，乳腺炎奶牛和小鼠共有6条相关的代谢途径：TCA循环、半乳糖代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、脂多糖生物合成和硒复合代谢，这六条途径在乳腺炎中均为低丰度（图5）。
除此外，牛和鼠中绝大多数与疾病相关的KOs不同：奶牛体内的KOs具有特定于疾病的维生素B代谢途径的富集，而小鼠体内的KOs具有特定于疾病的细菌趋化性和鞭毛聚集的缺失。这些结果表明，在奶牛到小鼠的跨物种FMT中，乳腺炎症状可以重现，伴随着健康和患病微生物群之间的区别的扩大，以及乳腺炎相关的OTUs和微生物功能的显著变化。图5P组和M组之间以及M组和H组之间的代谢途径变化
图6健康与患病奶牛的肠道菌群差异，在受体小鼠中被放大。与乳腺炎相关的OTU和微生物功能也显著变化
图7乳腺炎奶牛和小鼠共有的代谢途径
讨论
此研究表明，患乳腺炎奶牛的FMT可以引起无菌小鼠的乳腺炎，并且牛的乳腺炎不一定是乳腺的局部感染，可能是肠道菌群功能失调所致。乳腺炎奶牛肠道菌群发生了很大的功能变化，如维生素B代谢和碳代谢活性的抑制。奶牛到小鼠的跨物种FMT尽管导致了相同的乳腺炎症状，但乳腺炎相关细菌的组织或功能标记物在患病牛和小鼠之间相差很大。这进一步说明乳腺炎可能是由肠道微生物群引起的。因此，恢复肠道生态系统功能（如乳腺炎相关途径）可能成为治疗奶牛乳腺炎的有效方法，为乳腺炎的治疗和药物开发指明了新的方向。
乳腺炎几乎影响所有哺乳哺乳动物，并且通过FMT可以重述乳腺炎的关键生理和免疫特征。因此，乳腺炎可以作为研究肠道微生物群、哺乳动物基因组和炎症疾病共同进化的新研究模型。该模型还有疾病症状测量相对容易，疾病发生和发展的时间跨度短以及可干预其发展等优点。此外，探究奶牛-小鼠FMT中乳腺炎相关微生物群结构和功能的“放大效应”，可以为合理选择动物模型和FMT实验提供新的思路，也可以更深入地探讨肠道菌群在乳腺炎发病中的作用机制。
评论
传统的兽医学认为奶牛乳腺炎是由于病原菌感染乳头导致的，常采用抗生素治疗，有时治疗结果适得其反。本研究解析了健康奶牛和乳腺炎奶牛肠道微生物的组成和功能结构，发现菌群结构和代谢途径存在显著差异，尤其是乳腺炎奶牛肠道中维生素B代谢极其紊乱（维生素B是许多生化反应的辅助因子，可抑制炎症），基于上述发现，提出了肠道菌群失衡引发奶牛乳腺炎的理论。
运用奶牛到无菌小鼠的粪菌移植证实了肠道菌群失调可以引发乳腺炎，并且采用益生菌可以有效恢复肠道功能，缓解乳腺炎症。这为奶牛乳腺炎的缓解和治疗提供了新的方向，具有重要的经济效益和社会效益。此外，跨物种粪菌移植后肠道结构和功能的“放大效应”也为进一步探究乳腺炎的发病机制提供了新的思路。
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